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第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定上海师范大学硕士学位论文存。

归档日期:07-09       文本归类:观察配系要图      文章编辑:爱尚语录

  第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定上海师范大学硕士学位论文存。固体培养基的配制取 琼脂粉 加入 液体培养基中 高温灭菌 当温度下降至 左右 加入 旋转混匀后 适量倒入高压灭菌后的平皿中 冷却凝固后 倒置平皿 保存。 血涂片观察、测量血涂片于显微镜 下观察 利用计算机图像分析系统和测量使用 软件分析母配

  第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定上海师范大学硕士学位论文存。固体培养基的配制取 琼脂粉 加入 液体培养基中 高温灭菌 当温度下降至 左右 加入 旋转混匀后 适量倒入高压灭菌后的平皿中 冷却凝固后 倒置平皿 保存。 血涂片观察、测量血涂片于显微镜 下观察 利用计算机图像分析系统和测量使用 软件分析母配子体的形态和形态测量和感染寄生虫红细胞的变化。分析变量包括 寄生虫面积、长度和宽度和寄生虫的核、面积、长度和宽度 感染和未感染的红细胞和核的各项指标。 肝簇虫、感染与未红细胞各项指标分析利用 统计软件对所有记录数据进行了分析 肝簇虫个体之间的差异进行邓肯单向方差分析测试。正常和被感染的红细胞之间的差异比较采用 检验。 表示显著差异 表示高度显著差异。 分子生物学鉴定 蛇血液基因组 的提取对各条蛇的血液进行基因组 提取 按照基因组 提取试剂盒说明进行操作 具体步骤如下 此蛇抗凝血可加缓冲液 补足 加入旺缓冲液 充分颠倒混匀 放置 溶液应变清亮 简短离心以去除管盖内壁的水珠。 加人 此无水乙醇 充分振荡混匀 此时可能会出现絮状沉淀 简短离心以去除管盖内壁的水珠。 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 吸附柱放入收集管中离心 倒掉废液 将吸附柱 放回收集管中。 向吸附柱 中加入 此缓冲液 使用前请先检查是否己加上海师范大学硕士学位论文第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定入无水乙醇 倒掉废液将吸附柱 放入收集管中。 向吸附柱 中加入 皿漂洗液 使用前请先检查是否己加入无水乙醇 离心 倒掉废液 将吸附柱 放入收集管中。 重复操作步骤 将吸附柱放回收集管中 离心 倒掉废液。将吸附柱 置于室温放置数分钟 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 将吸附柱 转入一个干净的离心管中 向吸附膜的中间部位悬空滴加 此洗脱缓冲液 室温放置 离心 将溶液收集到离心管中。 部分基因扩增根据文献设计引物 所用引物见表 引物由上海赛百盛生物公司合成。 基因片段 反应体系如下 试剂 引物基因组总体系反应程序 体积 基因片段反应体系如下 试剂体积 引物 引物 基因组 总体系 反应条件为 产物进行琼脂糖凝胶电泳 对鉴定为阳性的 扩增产物进行切胶回收按照上海捷瑞生物工程有限公司普通琼脂糖凝胶 回收试剂盒的方法 回收步骤如下 在紫外灯下用清洗干净的手术刀片尽可能快地切下包含目的片段的凝胶块 装入预先称过重量的 离心管中 称取凝胶重量。 上海师范大学硕士学位论文第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定 向离心管内加入 水浴至凝胶完全融化 中间可拿出颠倒混匀 将溶液转移到套放于收集管中的 室温下放置离心 取出 溶液漂洗离心 离下漂洗液 倒掉管中废液 重复用 溶液漂洗一次 打开觚柱盖子室温放置 使残留的乙醇彻底挥发。 小心地向 锄柱膜中央悬空加入 此预热到 离心离心收集到的液体即为该基因回收产物。 目的片段与 载体的连接与转化将回收的目的片段与 连接 连接体系 试剂体积 载体目的基因片段 连接酶 总体积 置于水浴中连接过夜 以上 。转化感受态细胞具体步骤如下 冰柜中取出一管感感受态细胞置于碎冰中。 待大肠杆菌 感受态细胞融化后 连接产物加入离心管内混匀并密封离心管后 冰上作用 取出离心管后迅速放入已经预热到的恒温水浴锅中热激 然后取出离心管在冰上放置 加入预热的液体培养基 到离心管中 先在固体培养基平板 第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定上海师范大学硕士学位论文表面涂上液体培养基 不含抗生素 再将 倒在平板表面上并涂匀。后取出菌液 离心 上清重悬菌液 并将菌液涂布于 固体培养基平板上。 将培养基平板先正放于 培养箱 待晾干后倒置培养 阳性克隆的鉴定及测序从过夜培养的 固体平板上长势良好的菌落中 随机挑取 个透明的单个菌落于 终浓度为液体培养基中 摇床中中速培养 此新鲜菌液作为模板 用之前的引物进行 扩增反应 反应完成后 止产物进行琼脂糖凝胶电泳观察条带 将与有预期分子量大小一致的菌液 送上海桑尼生物技术有限公司测序。 目的基因的拼接利用 网站上免费软件去除通用引物序列 再通过 软件找到两部分基因的在重叠部分 并将其拼接 即为目的基因序列。 系统进化树分析目的基因序列提交到 并得到登陆号 。目的基因序列进行 找到在 上最相似序列。在 下载到 条命名或未命名的肝簇虫 基因序列‘ 分析。先用选择最佳的建树模型 。利用软件 进行锄分析 具体的参数如下 。采用法运算 代取样一次从得到的样品中舍弃 的老化样本后 总结得到共有树。利用 进行最大相似法分析 使用 分析同样的模型和参数运行 代。参照 基因序列作为外群。上海师范大学硕士学位论文第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定表进化树所选用寄生虫种类寄生虫种类宿主 同上第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定上海师范大学硕士学位论文上海师范大学硕士学位论文第三章肝簇虫的形态观察与种类鉴定 结果 血涂片观察观察 显微镜下可观察到有细胞分别均匀染色效果较好的部位 可以用来分析细胞和肝簇虫形态。观察发现 仅在来自大王蛇的 张血涂片中发现有肝簇虫。所有观察到的肝簇虫都同处于母配子体阶段的形态 并且形态相近。 母配子体描述成熟的母配子体细长形 两端钝圆 一端大 另一端稍微细 并且在虫体细端形成一个约为 虫体核瘦长、致密通常在位于虫体的中间 但通常会向虫体两端伸展 虫体的核大小为 。虫体往往单独寄生于成熟的红细胞内偶尔出现同一个红细胞感染两个虫体的现象 大王蛇肝簇虫母配子体血涂片经姬母萨染色 虫体一靖的对折勾两个虫体蓐染同一个红细胞 受感染红细胞的核被推到细胞一边受感染红细胞核高度不规则 感染和未感染的红细胞受感染的红细胞涨大细胞质的染色变浅。受感染的红细胞大小为 。另外正常的红细胞大小为 。感染红细胞的长度宽度和面积比未感染的红细胞都要大伊 感染红细胞的核通常被虫体推到细胞的一边 变得不规则。它们的大小为 受感染红细胞的核的长和宽均比正常红细胞的要大但它们的核面积几乎不 基因组 提取及 扩增结果 根据试剂盒说明书的方法 分别提取 条蛇血液基因组 。根据文献设计的引物 扩增肝簇虫龇两部分特异片段。所有镜检阳性的个体 引物进行扩增时也呈阳性 然而 虽然在镜检时呈阳性 但是用 引物进行扩增时 出现阴性结果。通过 软件找到两部分基因的在重叠部分 并将其拼接 即为目的基因序列 序列长度为 与目标基因长度相符合。 系统进化树分析利用最大相似法 推算分析肝簇虫序列之间的进化关系基本一致 从进化树的拓扑结构可以看出来源于不同宿主的肝簇虫分为两个大支 说明结果可靠。其中一个大支是由来自哺乳类动物和爬行动物的肝簇虫。另一个进化枝是由来自两栖动物、爬行动物、哺乳类动物和大王蛇的肝簇虫组成并且所有来自大王蛇的肝簇虫组成了小分支 并与其他肝簇虫种类区分开来。虫进化树结果可以看出 与本次实验的肝簇虫关系最近的是来自色鼠的肝簇虫 其次是来自姐妹分支的大鬼鼠肝簇虫和球蟒肝簇虫——表 条自然感染肝簇虫的大王蛇正常与受感染红细胞比较分析 感染

  三种蛇寄生虫感染情况调查及种类鉴定调查,种蛇,三种,调查及,虫寄生,鉴定种类,种类鉴定,分类鉴定,蛇寄生,鉴定虫

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